多光子显微镜成像技术：多光子显微镜中的焦点深度扩展方法
双光子激光扫描显微镜结合钙指示剂是活体神经元信号探测的金标准。神经网络中的神经元分布在三维空间中，监测它们的活动动态需要一种能够快速提高体积成像速率的方式。但是，使用光栅扫描多光子显微镜对大量图像进行成像，如果采用高数值孔径（NA）的物镜来获得较高的横向分辨率时，会导致较小的聚焦深度，为了获得小聚焦深度下的体积成像，
必须通过一些手段进行Z轴扫描，通过扫描每个焦平面来成像许多平面，这大大限制了成像速度。如果可以牺牲轴向图像信息，通过扩展焦深在一次横向扫描中实现体积扫描，也就是体积信息被投影到单个2D图像中，就可以大大提高成像速度，这被称为扩展焦深（EDF）成像，对于要求高时间分辨率的稀疏群体结构成像（例如神经元活动的功能成像）特别有用。
显微镜的轴向和横向分辨率均由物镜的数值孔径（NA）决定。高NA可使轴向和横向分辨率以及所收集的光量最大化；较低的NA将产生较低的轴向分辨率，即更长的焦深，但同时会牺牲横向分辨率和光收集效率。接下来要介绍的扩展焦深的方法，能够在保持高横向分辨率和足够通光量的同时实现扩展焦深。
使用空间光调制器产生焦点细长的贝塞尔光束可以实现EDF成像，但空间光调制器体积大，很难与狭窄的显微镜空间兼容；相比之下，基于轴棱锥的贝塞尔模块便宜且紧凑，但它只能产生固定深度的焦点，不适合用于需要焦深连续变化的各种实验。为了解决这个问题，2018年，RONGWEN LU等人展示了一种基于轴棱锥的贝塞尔模块，只需要在该模块中沿光轴平移一个透镜，就可以连续调节贝塞尔焦点的轴向长度。
图1（a）贝塞尔模块装置图；（b）当D分别为－12mm，0mm和12mm时实验测得点扩散函数；（c）横向半高全宽、（d）轴向半高全宽、（e）峰值信号和（f）物镜后光功率随L2位移D的变化关系
形成长度可变的贝塞尔焦点的模块装置如图1a所示，入射的高斯光束经过轴棱锥和透镜L1之后被整形为环形光束，紧接着的环形光圈掩模可以阻挡由轴棱锥缺陷引起的杂散光，从而塑造双光子激发点扩散函数的轴向分布。之后光束被透镜L2和L3投射到振镜上，再通过透镜L4和L5到达物镜的后焦面。
这些设计与传统的基于轴棱锥的模块类似，不同之处在于通过沿光轴移动L2或L3，可以连续调节贝塞尔焦点的轴向长度。图1b显示了D分别为－12mm，0mm和12mm时的轴向点扩散函数，其轴向半高全宽分别为39?m，24?m和14?m。如图1c－f，从左至右移动透镜L2可以连续改变横向和轴向的半高全宽，也就是可以连续改变焦深，且基于矢量衍射理论的数值模拟结果与实验数据非常吻合。图2验证了不同尺寸的环形掩模对轴棱锥缺陷的校正作用，发现较薄的环形掩模能够更好地优化输出贝塞尔光束的轴向强度分布，但同时也会导致更多的功率损耗。
图2不同环形掩模得到输出焦点的轴向强度分布。无掩模（红色实线）；掩模1（蓝色实线）；掩模2（黑色实线）；模拟结果（黑色虚线）
图3 a，b：使用高斯光束的体成像结果；c－j：使用贝塞尔光束不同D值时的成像结果
该组分别使用高斯光束和贝塞尔光束对斑马鱼中脑和后脑的脊柱神经元进行成像（图3），发现即使使用最短的贝赛尔焦点也能比使用高斯光束扫描更多的神经元，并且可以提供和二维高斯扫描方式相当的横向分辨率。最后，该组对斑马鱼幼虫脊髓投射神经元进行体积钙成像（图4），研究了参与逃避行为的斑马鱼的神经元动态过程，采用体积速率为50 Hz的贝塞尔光束监测这些神经元的活性，鉴定出其中的15个神经元，这些神经元表现出敲击诱发的钙瞬变。与高斯光束相比，使用贝塞尔光束时体积速率提高了26倍。
图4斑马鱼幼虫脊髓投射神经元体区域的50 Hz钙成像
除了以上提到的使用空间光调制器和轴棱锥来获得贝塞尔光束的方法外，早年最简单的方式是使用环形狭缝和傅里叶变换透镜，透镜会对经过环缝的光场作傅里叶变化，在其后焦面处产生近似贝塞尔光束，但是使用一个简单的环形孔扩展焦深会导致光的大量损失，只有一小部分可用的光会通过环面传输，会影响成像。
为了解决使用单个环扩展焦深光通量不够的问题， BINGYING CHEN等人利用超短脉冲相干长度短的特性，采用多环结构的分束掩模，超快激光脉冲经过时会被分束掩模分成不同的环形子束，每个子束都有时间延迟，也就是每个子束在不同的时间点在物镜的焦平面上形成贝塞尔焦点。如果每个环引入的时间延迟大大超过了激光脉冲的持续时间，则子束将互不相干，产生的EDF焦点是所有单个贝塞尔焦点的非相干叠加，如图5所示。
图5 a：分束掩模结构图；b：分束掩模扩展焦点深度的原理示意图；c：模拟的不同环形光非相干叠加的结果（1－5表示由内到外，EDF：深度扩展后的焦点）
基于实验设计的掩模参数，该组进行了数值模拟，结果如图6，最大NA为0．67时计算得到的横向和轴向分辨率分别为550nm和15．98μm，比常规聚焦方式的轴向尺寸大4．96倍，而横向半高全宽仅比常规聚焦方式大7％。
图6 点扩散函数的数值模拟结果
该组搭建的实验装置如图7所示，由钛宝石激光器输出的中心波长900nm，脉冲宽度140fs的超短脉冲通过普克尔盒进行功率调节，经过扩束器后进入掩模，掩模每层的厚度约为400μm，对脉冲提供的时间延迟为720fs，满足非相干叠加的要求。之后光束经过一系列透镜和两个振镜被耦合至物镜光瞳平面，实现扩展焦深成像。
图7 实验装置图。1：普克尔盒，光隔离器；2，4，7，8，18：透镜；3：圆孔；5：虹膜；6：分束掩模；9，12：振镜；10，11：普罗素目镜；13：扫描透镜；14：管状透镜；15：二向色镜；16：物镜；17：滤波器；19：光电倍增管
对输出光束的点扩散函数测量结果如图8所示。对比有掩模和无掩模的点扩散函数发现，有掩模时的轴向半高全宽是无掩模情况下的5．8倍，横向半高全宽增加15％。降低无掩模条件的NA使得轴向半高全宽和有掩模时一致，横向半高全宽增加约1倍。上述结果说明该掩模能在略微牺牲横向分辨率的条件下显著提升焦点深度。为了验证分束掩模在神经科学成像中的应用潜力，该组还展示了固定小鼠脑样本中GFP标记的神经元的荧光成像。
图8 点扩散函数测量结果。
总之，对于稀疏群体结构，采用上述扩展焦深成像的方法，可以在保持横向分辨率和光通量的同时扩展焦深，进而大大提高成像速度，这在活体神经元信号探测方面十分有潜力。